蘇州千舍生物-細胞培養(yǎng)知識之細胞液黑色運動顆粒物

在細胞培養(yǎng)中常可見到細胞及培養(yǎng)液中有一些大小不等、形態(tài)不同的黑色顆粒在運動。如果鏡下檢查(100x)每視野計數(shù)在10個以上者就可能使細胞生長受到影響，如果其數(shù)量再增多細胞可停止增殖繼而死亡。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒。

一、關(guān)于黑膠蟲的描述

1、分類上的描述：對于黑膠蟲的分類，學術(shù)界沒有明確給予說法。關(guān)于黑膠蟲的分類，目前大部分人認為黑膠蟲污染是微生物感染。在一些文章論述上把黑膠蟲歸為生物污染類型，但是沒把它歸為確定的生物分類類型，只是把黑膠蟲獨立為一種未知生物。而根據(jù)中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，但是由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)下去，終也沒有有力證明黑膠蟲是屬于原蟲。也有一些學者不認為所謂的黑膠蟲污染是一種生物污染，而認為是細胞碎片類物質(zhì)，是在細胞培養(yǎng)時，細胞衰亡破裂產(chǎn)生的；也有在文獻中報道說是玻璃瓶中類似氧化硅的物質(zhì)，那個文獻很少人找得到；還有報道黒膠蟲是一種納米級的細菌。

2、形態(tài)上的描述：形態(tài)上類似與桿狀細菌，但長度比細菌長，直徑約在0.5~1微米，顯微鏡觀察為黑色，膠蟲成熟后呈線狀，而且形態(tài)是橢圓形。

運動形式：在400x倒置顯微鏡小，有典型的布朗運動（不規(guī)則的原地小距離抖動），即很多細胞培養(yǎng)者看到的，像黑色的小蟲游來游去?？梢源┩笧V膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。但是在物理學上來說，顆粒足夠小，在液體中也是做布朗運動的，這不足以說明黑膠蟲的布朗運動就證明它是生物。

3、生理上的描述：

3.1抗性

抗細菌和抗霉菌的藥物對黑膠蟲均無效，可以保守的判定黑膠蟲不屬于細菌。

3.2環(huán)境抗逆性

將培養(yǎng)器材150度烘烤8小時，可以消除，而黑膠蟲高壓滅菌泡酸都不死。可見黑膠蟲可以耐高溫高壓，而且還有點嗜酸，如果證實它是生物的話，那它很有可能是微生物，一種古菌。

3.3營養(yǎng)條件

“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細胞傳代而傳代?？梢?ldquo;黑膠蟲”可能是一種異養(yǎng)生物。

二、對黑膠蟲的各種猜測

1.非生物類

1.1細胞碎片類

在細胞培養(yǎng)的時候， 由于細胞代謝、物質(zhì)交換、周邊環(huán)境變化，尤其是在從37度培養(yǎng)箱中拿出來觀察的過程中，由于液體培養(yǎng)基的比熱較大，液內(nèi)溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內(nèi)形成液體流動加劇，當然這些小歲末就會被攪動起來形成似乎“游動”的感覺；隨著細胞培養(yǎng)的繼續(xù)，部分細胞開始衰亡，細胞膜結(jié)構(gòu)破裂，破裂之后的細胞內(nèi)容物泄露到培養(yǎng)液中。尤其是溶酶體的破壞，連續(xù)性地造成其他細胞和細胞器的損傷，如果換液不很勤，又會出現(xiàn)進一步破壞和殘渣的出現(xiàn)；再者，“黑膠蟲”問題是很多細胞培養(yǎng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的問題，但到目前為止尚未找到其監(jiān)測和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“黑膠蟲”病原體根本難以收集和捕捉，這也從另一個側(cè)面證明了“黑膠蟲”問題的難以確定性；再說任何一種外來的微生物在培養(yǎng)基中都會有生命活動的反應(yīng)和表現(xiàn)，而不是簡單地運動那樣的外觀性表現(xiàn)。舉一個例子：如果“黑膠蟲”的運動狀況已經(jīng)到了用顯微鏡已經(jīng)可以觀察出的程度，其營養(yǎng)代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養(yǎng)液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發(fā)生明顯變化。比如說：迅速的、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，細胞大量破碎死亡、引發(fā)其它類型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“黑膠蟲”感染中，是很難觀察到的。同時“黑膠蟲”的出現(xiàn)而影響細胞狀態(tài)似乎得不到有力的證據(jù)。倒是細胞狀態(tài)下降的時候，“黑膠蟲”明顯增多了。很有可能是細胞狀態(tài)下降時，細胞衰亡產(chǎn)生的細胞碎片。所以黑膠蟲屬于細胞碎片是比較可能和合理的。

1.2玻璃培養(yǎng)瓶中的類似氧化硅的東西

網(wǎng)上有一篇文章說，黑膠蟲其實不是一種生物，是無機物，其本質(zhì)是玻璃培養(yǎng)瓶里的硅顆粒?？捎绊懠毎L，細胞狀態(tài)好時，不明顯。細胞狀態(tài)較差，數(shù)量少時才容易看到，的辦法是用一次性培養(yǎng)瓶，可消除黑膠蟲影響。

血清聚合物產(chǎn)物

Hyclone胎牛血清SH30084.03  、Hyclone胎牛血清SH30406.02  、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E 、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活 SH30068.03HI 、馬血清SH30074.03  、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 、Hyclone胎牛血清SH30071.03 、Hyclone胎牛血清SV30160.03。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS 、BOVOGEN新生牛血清 SNCS。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 、PAA 優(yōu)等胎牛血清FBS A15-151。

BI優(yōu)等胎牛血清 04-001-1ACS 、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A 、

BI 間充質(zhì)胎牛血清 04-400-1A 。

Corning胎牛血清 35-076-CV。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P 。

NTC優(yōu)等胎牛血清 SFBE。

Gemini優(yōu)等胎牛血清 900-108 、Gemini特級胎牛血清 100-500  、Gemini科研用人AB血清100-512 。

TCB胎牛血清 101ZC。

Sigma 特級胎牛血清F2442 、Sigma正常人AB血清 H4522 。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02、馬血清16050-122。

雙抗15140-122、SV30010  、胰酶 25200-056、SH30042.01 、GIBCO 胰酶 25200-072。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結(jié)腸癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結(jié)腸癌細胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細胞

RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經(jīng)上皮瘤細胞

SK-N-SH 人神經(jīng)母細胞瘤細胞 、SW982 人滑膜肉瘤細胞

T98G 人膠質(zhì)母細胞瘤 、U251MG(KO) 人類星形膠質(zhì)細胞瘤細胞

U266 人骨髓瘤細胞 、VCAP 人前列腺癌細胞

hTERT-HPNE 人胰腺導管細胞 、ES-2 人卵巢透明細胞癌細胞

NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞 、H460 人大細胞肺癌細胞

HACAT 人永生化角質(zhì)形成細胞 、HCT116 人結(jié)腸癌細胞

HEK293 人胚腎細胞  、HEPG2 人肝癌細胞

HGC27 人胃癌細胞(未分化) 、HT-29 人結(jié)腸癌細胞

HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 、KYSE150人食道癌細胞

L02(HL7702)人正常肝細胞   、LOVO 人結(jié)腸癌細胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細胞 、MCF7人乳腺癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞 、MDA-MB-468人乳腺癌細胞

2、生物類

2.1支原體

有人曾認為黑膠蟲可能是支原體污染，因為相對比較quan 威的網(wǎng)站文章指出，黑膠蟲可以通過濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實驗證明黑膠蟲不會是支原體，原因如下：

a、光鏡下可見，因為體積不對，支原體在普通顯微鏡下不能看到。

b、多種染色后可見，甚至hoechst即能將它染色，一般來說支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，黑膠蟲是一種支原體的可能性比較小。

2.2真菌

有很多人發(fā)現(xiàn)類似黑膠蟲的，但后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明黑膠蟲不存在只是細胞培養(yǎng)中的真菌感染，還是說明黑膠蟲污染屬于真菌類污染物。如果黑膠蟲是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關(guān)注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“黑膠蟲”是真菌的細胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了，要進行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導致培養(yǎng)失敗，所以黑膠蟲是一種真菌也是不太可能。

2.3寄生類原蟲

黑膠蟲屬于寄生類的原蟲，而不是細菌、支原體，也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到膠蟲有兩種不同形態(tài)，一種較大，運動較慢，泛紅光；另一種較小，運動較快，紅中帶綠，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗，單純培養(yǎng)過污染膠蟲的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的膠蟲。給人的感覺是膠蟲和細胞一樣有叢集性，如果膠蟲密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待膠蟲生長到一定濃度后便會飛速分生，細胞受感染的程度也大，這時除了培養(yǎng)基中可見外，細胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制膠蟲的生長。據(jù)說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經(jīng)費不夠而不能繼續(xù)進行下去，所以并沒有明確的證據(jù)證明此項猜測的正確性。

三、解析

從前面關(guān)于黒膠蟲的描述可以看出，人們遇到的黒膠蟲并不都是一樣的，有像細菌的、有像支原體的、有像原蟲的、有像真菌的，還有像細胞碎片的。在國內(nèi)各實驗室的器材條件參差不齊，而且實驗人員的操作質(zhì)量也不盡相同，同一種現(xiàn)象也可能有些許差異，當用描述出來的現(xiàn)象的差異可能變大也可能變小。所以很多人看到細胞被細菌污染了，不好處理，而卻描述出來的現(xiàn)象和流傳的黑膠蟲類似，就會把培養(yǎng)失敗的原因歸結(jié)到無法處理的黒膠蟲污染，甚至可能說它發(fā)現(xiàn)的是真正的黑膠蟲。這樣的事情多了，黑膠蟲就會人為的變種，像什么的都有。黑膠蟲是否存在，還有待于科學的發(fā)展。但有一點可以肯定的，大部分人發(fā)現(xiàn)的“黒膠蟲”并不是真正那個未知的黒膠蟲，而是常見的細菌、真菌、原蟲等微生物污染。

關(guān)于黑膠蟲quan 威的報道。在《細胞生物學雜志》有一篇關(guān)于《對細胞培養(yǎng)中一種黑色運動顆粒性質(zhì)的研究》論文，文中經(jīng)過多種實驗驗證后指出：“在組織培養(yǎng)中常觀察到一種大小不等、形態(tài)不同的黑色運動顆粒，它對培養(yǎng)細胞的生長有不良影響，有時甚至導致細胞死亡，并能在一定條件下隨培養(yǎng)時間的增長而增加其數(shù)量。人們常稱這種顆粒為黑膠蟲或中毒顆粒，我們?nèi)〖毎囵B(yǎng)用的血清、培養(yǎng)基和其他材料中的黑色運動顆粒，應(yīng)用光學顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡對其形態(tài)學進行系統(tǒng)觀察；并用顯微攝影觀察其活動情況；用紫外分光及電泳透析進行生化分析，結(jié)果均證明該顆粒為無膜式結(jié)構(gòu)，無蛋白質(zhì)成分，中性環(huán)境下帶正電荷，能譜掃描電鏡分析為硅復(fù)合物，我們稱之為硅小體(B)，證明其活動屬布朗運動。本文進一步用電感耦合等離子發(fā)射光譜分析了培養(yǎng)液及雙蒸水中可溶性的硅含量在不同質(zhì)量的容器及不同時間的變化，證明了硅小體的增多主要來源于培養(yǎng)液對玻璃器皿的侵蝕，部分來源于被培養(yǎng)的細胞。