細(xì)胞培養(yǎng)中，使用培養(yǎng)板時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、96，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松，這樣是方便了透氣，但是細(xì)菌、霉菌等污染物會(huì)不會(huì)也隨著溜進(jìn)去呢?

答：（1）蓋子很松，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣(實(shí)際上是為了使培養(yǎng)皿外的co2能夠與培養(yǎng)皿充分交換，維持培養(yǎng)基的pH值)。

（2）有利必有弊，這樣增加了污染的可能性。此外這樣還會(huì)使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā)，這對(duì)于精確定量的藥物來(lái)說(shuō)就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的：

a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔(定期紫外線照，酒精擦洗，盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱)

b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內(nèi)放置無(wú)菌蒸餾水的水槽)。注意無(wú)菌操作！

2、我的細(xì)胞接種培養(yǎng)板，細(xì)胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊?我看有的戰(zhàn)友的細(xì)胞卻是聚集在中間，是不是板子的質(zhì)量問(wèn)題?

答：請(qǐng)問(wèn)你的細(xì)胞是如何混勻的?是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板?如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細(xì)胞中間少，四周多！自己可以試試！

一個(gè)好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和后再取出，種入細(xì)胞時(shí)力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長(zhǎng)。記住千萬(wàn)不要用振蕩器振蕩，否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說(shuō)得那樣聚積在一起。

3、我的細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里(不管加藥和對(duì)照)，總有兩三個(gè)孔(隨機(jī))細(xì)胞長(zhǎng)得不好，很小，像破碎了。有人遇到過(guò)這種情況嗎?到底是啥原因呢?

答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細(xì)胞剛剛拿出來(lái)?yè)Q液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來(lái)不久，很容易細(xì)胞就會(huì)凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。

另外，跟你細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。

或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問(wèn)題，你再換換其它培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問(wèn)題了，種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下。

4、最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個(gè)圓是好的，下半個(gè)圓就不好，這是怎么一回事?

答：你可以看一下是不是以下這幾個(gè)原因

a、培養(yǎng)板沒(méi)放水平；

b、你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過(guò)期，細(xì)胞就不會(huì)貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試

c、可能是板的問(wèn)題，換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒(méi)問(wèn)題了。

d、換培養(yǎng)基的時(shí)候有沒(méi)有注意風(fēng)機(jī)的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí)，容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕浪費(fèi)吸管，注意操作的效率!

5、把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長(zhǎng)不滿，每天換液時(shí)都用PBS 清洗，第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長(zhǎng)的很好，中央大量死細(xì)胞?

答：如果細(xì)胞周圍密而中間稀疏，大約有如下原因：

培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問(wèn)題。

培養(yǎng)箱底部的水是否少了；

細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍。

細(xì)胞分布均勻與否有一點(diǎn)很關(guān)鍵，即每種細(xì)胞是有個(gè)體差異的，別人的細(xì)胞操作不一定適合于你。所以要靠自己摸索，且找出專屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律，有如下經(jīng)驗(yàn)：

（1）所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。

（2）按資料記載，24孔板的液體量為1ml，其實(shí)1ml的量足矣。

（3）接種時(shí)，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個(gè)加樣處聚集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊活動(dòng)槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布。這樣做對(duì)細(xì)胞均勻分布有一定效果。

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