細(xì)胞傳代時(shí)消化的操作方法？

可以這樣說(shuō)，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好最至關(guān)重要的考驗(yàn)。

很多同學(xué)都遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題，自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長(zhǎng)的還挺好的，可是穿過(guò)幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了，狀態(tài)越來(lái)越差勁了。對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，可以非常肯定地說(shuō)，你的消化環(huán)節(jié)出問(wèn)題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了。所以，越長(zhǎng)越差。

    在消化的過(guò)程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問(wèn)題就是，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒(méi)有那么牢固的，所以，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會(huì)有脾氣啊。我后來(lái)對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良，我稱之為四步消化法，以難消化細(xì)胞為例，具體操作如下：

1.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍。這是前奏，即為第一步，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。

2.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來(lái)。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶，即為第二步。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過(guò)的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰(shuí)長(zhǎng)的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度了。

3.吸干凈瓶?jī)?nèi)剩余液體，加入 0.3 mL 左右的胰酶潤(rùn)洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 mL 左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 mL 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對(duì)比。這是第三步。

4.然后把前面剛吸出來(lái)的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開來(lái)的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)際情況你自己把握。

其實(shí)還可以有第五步，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒(méi)辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能最大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠優(yōu)。

當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒(méi)必要第三步第四步了。這個(gè)是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會(huì)的。建議你接手一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來(lái)做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求，便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。

因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系，大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)是非?？季磕愕墓Ψ虻?。

細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè)，因?yàn)樗麤](méi)有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)他吹打的力分散開細(xì)胞。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理。

既要消化到容易吹打下來(lái)，又不能太過(guò)，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活或死的致命點(diǎn)，像 Caco-2 細(xì)胞就是如此。

另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長(zhǎng)到 70% 左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代，不能再拖。

人胚腎細(xì)胞 HEK-293（293） MEM+10%FBS+1%P/S 貼壁+懸浮生長(zhǎng)

人胚腎細(xì)胞 HEK-293A DMEM+10%FBS+1%P/S 貼壁+懸浮生長(zhǎng)

人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系 5-8F  1640+10%FBS+1%P/S    貼壁生長(zhǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞 C666-1 1640+10%FBS +1%P/S 貼壁生長(zhǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞 NPC/HK-1 1640+10%FBS +1%P/S 貼壁生長(zhǎng)

豬鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞 PT-K75 DMEM+10%FBS+1%P/S 貼壁生長(zhǎng)

人卵巢癌細(xì)胞 A2780 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%P/S   

人卵巢癌細(xì)胞+GFP A2780+GFP 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%P/S  

人卵巢腺癌細(xì)胞 CAOV-3 DMEM(含NaHCO3 1.5g / L)+10%FBS+1%P/S

人卵巢癌細(xì)胞 CoC1  1640+10%FBS+1%P/S  

人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞 ES-2 McCOY's 5A +10%FBS+1%P/S

人卵巢癌細(xì)胞 HEY DMEM+10%FBS+1%P/S  

人卵巢癌細(xì)胞 HEY A8 DMEM+10%FBS+1%P/S

人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞 HO-8910PM 1640+10%FBS+1%P/S

人正常卵巢上皮細(xì)胞系 IOSE-80（IOSE80;NFHIOSE-80;IOSE80UBC;IOSE-Van; IOSE-VAN） 1640+10%FBS+1%P/S

人卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞 KGN D/F12+10%FBS+1%P/S

人卵巢腺癌細(xì)胞 OVCAR-3 1640(含NaHCO3 1.5g/L)+20%FBS+1%P/S + 0.01mg/ml牛胰島素

人卵巢癌細(xì)胞 SK-OV-3 Mccoy`s 5A +10%FBS+1%P/S

人卵巢癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-OV-3+LUC Mccoy`s 5A +10%FBS+1%P/S

小鼠卵巢上皮癌細(xì)胞 ID8 DMEM+10%FBS+1%P/S  

倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO DMEM+10%FBS+1%P/S

倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞,二氫葉酸還原酶缺陷 CHO/dhFr- IMDM+10%FBS+P/S1%+0.05mM次嘌呤+0.016mM胸腺嘧啶+100nM氨甲喋呤。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞k1 亞克隆系 CHO-K1 F12K+10%FBS+1%P/S

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞k1 亞克隆系 CHO-K1（懸浮） CHO GROW CD2培養(yǎng)基+1%L-谷氨酰胺+1%P/S

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CTLA4 IG-24 DMEM+10%FBS+0.2mM脯氨酸+0.001mM氨甲蝶呤+1%P/S

倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 LEC-1 MEMα+10%FBS+1%P/S

人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞 95-D  1640+10%FBS+1%P/S

 人肺癌細(xì)胞 A549  F12K+10%FBS+1%P/S   

 人肺癌細(xì)胞+RFP A549+RFP F12K+10%FBS+1%P/S

 人肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 A549+luc F12K+10%FBS+1%P/S

人肺癌細(xì)胞 Calu-1 MCCOY'S 5A+10%FBS+1%P/S  

人肺癌細(xì)胞 DMS 53 Waymouth's MB 752/1 medium (Invitrogen, 11220-035)+10%FBS+1%P/S

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 HCC827 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%丙酮酸鈉+1%P/S

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 HCC827+LUC 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%丙酮酸鈉+1%P/S

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H1299 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%（10mM）HEPES +1%丙酮酸鈉+1%P/S

人肺癌細(xì)胞 NCI-H1437 1640+10%FBS+1%丙酮酸鈉+1%hepes+1%PS

人經(jīng)典小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-h1688 1640+20% FBS+1%P/S 細(xì)胞漲的慢2-3周發(fā)貨

人肺癌細(xì)胞 NCI-H1703 1640+10% FBS+1%P/S

人肺癌細(xì)胞 NCI-H1944 1640+10%FBS++1%PS

人肺癌細(xì)胞 NCI-H2126 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%丙酮酸鈉+1%P/S

人肺癌細(xì)胞 NCI-H2228 1640+10%FBS+1%P/S+1%L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉

人肺癌細(xì)胞 NCI-H23 1640+10%FBS+1%P/S+1%L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉

人肺癌細(xì)胞(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移) NCI-H292 1640+10%FBS+1%P/S

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H358 1640+10%FBS+1%P/S

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446 1640+10%FBS+1%PS

人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H460 [H460]  1640+10%FBS+1%P/S+1%L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H524  1640+10%FBS+1%P/S

人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H661[h661]  1640+10%FBS+1%P/S

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H82 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉+1%P/S

人肺癌細(xì)胞 pc-9 1640+10%FBS+1%P/S

人小細(xì)胞肺癌 SBC-2  1640+10%FBS+1%P/S   

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 SHP-77 1640+10FBS+1%L-谷氨酰胺+1%丙酮酸鈉+1% PS

小鼠肺癌細(xì)胞 LLC DMEM+10%FBS+1%P/S

小鼠肺癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LLC+LUC DMEM+10%FBS+1%P/S

人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞 D283 Med  MEM+10%FBS+1%P/S

人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞 D341 Med MEM+1%丙酮酸鈉+1%NEAA+10%FBS+1%P/S  

永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 HCMEC/D3 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系（PriMed-iCell-002）

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 HS683 DMEM+15%FBS+1%P/S  

人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞 KNS-89 DMEM +10%FBS+1%P/S

人腦膠質(zhì)瘤 SNB-19 DMEM+10%FBS+1%P/S

人腦膠質(zhì)瘤 TJ905 DMEM+10%FBS+1%P/S

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 U118MG（U-118MG） DMEM+10%FBS+1%P/S

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 U87MG MEM+10%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%NEAA+1%P/S

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤+RFP U87MG+RFP MEM+10%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%NEAA+1%P/S

小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞 G422 DMEM+10%FBS+1%P/S

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株 bEnd.3 DMEM(含NaHCO3 1.5g/L)+10%FBS+1%P/S  

小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞 neuro-2a MEM+10%FBS+1%P/S

小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 neuro-2a+luc MEM+10%FBS+1%P/S

大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 C6 F12K +2.5%FBS+15%HS（馬血清）+1%P/S

大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記 C6+LUC F12K +2.5%FBS+15%HS（馬血清）+1%P/S

大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞 CTX DMEM+10%FBS+1%P/S  

大鼠腦I型星形膠質(zhì)細(xì)胞 CTX-TNA2 DMEM+10%FBS+1%P/S

大鼠腦間質(zhì)細(xì)胞 DI TNC1 DMEM+10%FBS+1%P/S